〔理論與基礎研究〕

行為遺傳的先天腎虛與先天用藥的實驗研究

 

王米渠  林喬  劉紹唐  嚴石林  馬向東  盧朝暉  彭興甫


           Miqu Wang, et al:   Abstract:   Filial generational mice having congenital kidney deficiency have abnormal heritage, it can be cured by T.C.M. formula Jingui-shenqi-wan according to the authors study. The result of experiment opens new field of vision in behavioral genetics, emotion psychology and pharmacogenetics.

 

           就遺傳而論,中醫的本質主要指本能行為(腎藏志的一個基本內容)和遺傳物質(極狹義之精)。恐嚇母代,可恐傷腎,造成下一代先天腎虛。先天腎虛便可表現在本能行為異常的宏觀表徵和遺傳物質變化的微觀表徵兩方面[1]。中醫有藥補腎的獨到見解,採用自然藥物能某種程度地康復腎氣,使子代本能行為康復。為了科學地論證中醫遺傳學思想的獨特理論,我們拓展了貓嚇母鼠恐傷腎,造成子代先天腎虛證的模型鼠,並植移了行為遺傳的經典實驗和新建立一些行為測試方法。通過對先天腎虛的初生鼠翻身測試,少年鼠空地測試、青年鼠走鋼絲測試和成年鼠取食芝麻測試,並增設藥補腎的反證其康復療效的作用。對先天(遺傳)腎虛證這一中醫重要的基礎證型,第一次進行了大膽的嘗試,改進了一系列的技術問題,提出了創新的思路與方法。

             材料與方法

           1.1  實驗的材料

           昆明封閉群種鼠75日齡,及其標準飼料,均由衛生部成都生物製品研究所動物中心提供。金匱腎氣丸,四川中藥廠生產(批號950025)4月齡黃色土貓一隻,貓籠一具(70cm×50cm×50cm)

           行為測試材料有:木板二張(90cm×90cm),上面畫有黃白相間的正方形(15cm×15cm)小方格,鋼絲直徑粗3mm,長2.5m,黑芝麻100克,錄音機及有貓叫聲的錄音帶。

           1.2  先天腎虛證子鼠造模

           母鼠48隻,雄鼠24隻,隨機分為恐嚇組、反證組、對照組和補腎組等四組。按雌雄 2:1比例進行交配,4天後取出雄鼠, 對恐嚇組和反證組進行恐嚇。方法是將貓籠置於鼠籠上面,母鼠既能看見貓的形象,又能聽到貓的叫聲[3],並製造貓爪拿、吃掉非實驗鼠的恐怖場面。每日9:00~11:0015:00~17:00,恐嚇一次。每天4小時,共恐嚇14天,直到生產前。反證組在恐嚇的同時補腎,飼料中伴有金匱腎氣丸懸濁液並烘乾,其量按成人體重比例的10倍量給予反證組母鼠。

           對照組和補腎組均無恐嚇,常規飼養與恐嚇組相同的飼料及取水。補腎組另服拌有金匱腎氣丸的飼料,其份量和飼養時間同反證組。

           上述4個組母鼠及其子鼠均置同一實驗室, 除恐嚇組和反證組在產前每天恐嚇 4小時在另一實驗室進行,其它務求條件一致。

           能產子母鼠於交配後的 19~22天時先後產子。得到先天腎虛(恐嚇組)、先天腎虛又補腎(反證組)、正常(對照組)、正常追加補腎(補腎組)的子代鼠。

           1.3  行為遺傳測試方法

           1.3.1  初生鼠翻身測試。對初生的當天

稱重後立即作翻身測試。方法是將初生鼠四腳朝天,背於實驗台,觀察在30秒鐘內能四腳著地者為翻身成功,否則為失敗。

           1.3.2  少年鼠和成年鼠空地測試。將25日齡和75日齡的子代鼠分別置於畫有方格的木板中央,用秒表計算5分鐘內爬行通過的格數,以4只腳進入一格為一分。

           1.3.3  青年鼠走鋼絲測試。將74日齡子代鼠置於60°傾斜2米長的鋼絲上端,用秒表計算爬行於鋼絲下端的時間。

           1.3.4  成年鼠取食芝麻測試。將91日齡的子代鼠飢餓15小時 (第一天17:00至次日9:00斷食,供水依舊),置於放有72粒黑芝麻的白色塑料盒中,計算7分鐘內所吃芝麻的數量 (包括整粒和部分被食的芝麻)。第一次測試未插入貓叫,第二次測試時同時播放其母親造模時貓叫的錄音。

           ·  顯著性檢驗方法,使用t檢驗。

              

           2.1  測試結果

2.1.1                     表1  子代初生鼠翻身成功率(`C±S, %)

條件

組別

成功(隻)

失敗(隻)

成功率(%)

恐嚇

恐嚇組

7

20

24.1±8.23

恐嚇+補腎

反證組

16

17

48.5±8.70※※

非恐嚇

對照組

24

31

43.6±6.68※※D

非恐嚇+補腎

補腎組

19

16

54.3±8.42※※

※※ 與恐嚇組比較 P<0.01    D 補腎組與對照組比較 P<0.05

2.1.2               表2  子代少年鼠與青年鼠空地測試(`C±S, )

條件

組別

少年(14 

)測試

青年(75

)測試

 

 

隻數(n)

`C±S()

隻數(n)

`C±S()

恐嚇

恐嚇組

17

 14.18±9.82

13

38.54±16.02

恐嚇+補腎

反證組

21

26.23±13.61¡

21

45.14±27.52

非恐嚇

對照組

20

33.85±25.52¡

12

47.96±23.59

非恐嚇+補腎

補腎組

12

29.67±14.25¡

12

45.75±16.59

※※ 與恐嚇組比較 P<0.01

2.1.3                表3  子代青年鼠走鋼絲測試(`C±S, )

條件

組別

隻數(n)

`C±S(秒)

恐嚇

恐嚇組

15

33.07±20.51

恐嚇+補腎

反證組

17

23.26±24.12

非恐嚇

對照組

15

22.13±10.49

非恐嚇+補腎

補腎組

11

19.64±10.02

與恐嚇組比較>2 Sd

2.1.4                 表4   子代成年鼠取食芝麻測試(`C±S, )

條件

組別

未插入貓

叫測試

插入貓

叫測試

 

                               

隻數(n)

`C±S(粒)

隻數(n)

`C±S(粒)

恐嚇

恐嚇組

13

  28.31±8.24

13

46.08±20.50

恐嚇+補腎

反證組

22

32.52±12.61

21

64.51±15.61

非恐嚇

對照組

18

27.94±13.07

18

70.72±3.08※※

非恐嚇+補腎

補腎組

12

22.17±11.15

12

65.92±6.90※※

與恐嚇組比較 P<0.05    ※※ P<0.01

           2.2   

           2.2.1  恐嚇(先天腎虛)組與對照組比較,子代初生鼠30秒內翻身率降低約一倍,少19.5個百分點;子代少年鼠空地測試, 其活動範圍在5分鐘內縮小了一倍多,少19.6格; 子代成年飢鼠7分鐘內取食芝麻數量減少約1/3,少24.1粒,經t檢驗,均達到非常顯著性差異。 子代青年鼠完成2米鋼絲的爬行時間增加了1/2,達2Sd值。

           2.2.2  恐嚇組與恐嚇後服補腎藥的反證組比較,後者4種測試均接近未恐嚇的對照組,t測驗差異無顯著性,提示了子代先天腎虛證遺傳行為失常者,金匱腎氣丸或可調節有關的基因表達,使其恢復正常。

           2.2.3  未恐嚇的正常鼠追加補腎藥與對照組的正常鼠比較,除翻身率外,t檢驗差異無顯著性,提示藥補腎在有關基因正常表達條件下,一般不產生加性效應。

              

           3.1  從行為遺傳學上來看,母代處於長期不良情緒的刺激下,對子代先天的情緒性及行為表現是有影響的。從上述實驗看,初生子鼠的翻身測試、少年子鼠的空地測試、青年子鼠的走鋼絲測試和成年子鼠的取食芝麻測試等均可以有行為上的異常。這在行為遺傳學上稱為宏觀表徵。當然要說明的是行為遺傳也重視微觀表徵,這批鼠從母代、初生、青年、成年,我們都作過54項生化、病理[4]、免疫等方面的微觀指標觀察,也有相當部分的類似結果,本文從略。

           早在本世紀中葉,行為遺傳學家湯普森(Thompson)就採用了空地測試的著名方法,考察母鼠懷孕期有過情緒不安的影響到後代的情緒性,形成經典之論。他的實驗中,少年驚恐組活動行為量減少了2/5[25],這與表2測試減少3/5結果相近。他作的成年鼠也減少了1/3 但我們作的結果沒有這樣明顯的差異。如果造模僅一代,到了成年在通常情景下,行為測試難有顯著的差異,我們此實驗中除成年子鼠空地測試外,成年子鼠取食芝麻等都未達到統計學上的意義。只是當我們建立了新的方法,採用插入貓叫錄音,放大先天恐懼後,才測出顯著性差異。當然,應該增加代數,進行選擇性交配,從遺傳進度檢測遺傳力大小,並進行滲入雜交、回交等,估計基因上位性及加性效應。從我們對不同年齡段的測試結果看出,隨著子代的年齡增長,環境影響程度漸增,而遺傳影響行為的程度漸減[6],可以分析這些與因子有關的遺傳力程度的高低。這種看法是我們的假說,還準備作多代的先天(遺傳)積累,進一步論證之。

           3.2  從中醫遺傳學觀點來看,第一步應建

立子代先天腎虛證的動物模型。貓嚇母鼠恐傷腎的自然造模方式,既合符中醫的臟象學說的理論,也合符實驗心理(行為)學的原理。這種自然天敵造模異於國外流行的電擊等理化條件造模方式,它的優點在於利用了貓與鼠的天敵關係,便於對一些習性在鼠類種群長期形成過程中形成遠因的追溯,對於腦分子遺傳等方面具有新的意義。值得進一步深入研究,也是弘揚中醫自然醫學中遺傳學思想的原理。

           腎為先天之本的理解,應集中於遺傳學的基礎上,它是通過特定的環境中形成的本能行為,及其決定個體性狀的遺傳物質。在子代先天腎虛組,根據本實驗生理、病理、生化等測試[4],說明腦的病理形態上有明顯變化,可作為初步的行為遺傳的微觀指標,它提示了在蛋白質、細胞、分子上可能有異常,這裡不多討論。 

           腎本的本能行為則是本文的重點,先天腎虛子代模型可見多種本能行為降低(甚至喪失而死亡),或異常。它從個體的、整體的、動態的行為測試反應出來,行為遺傳學稱謂的宏觀表徵,這恰恰是中醫臟象的,可通過外顯行為來量化之。本文中初生子鼠翻身成功率降低了近一(P<0.01),提示了先天腎虛鼠基礎的體質和原始的行為就低了一個檔次。少年子鼠空地測試中先天腎虛組比非驚恐組活動範圍減少了一倍多,說明了腎氣作強能力下降和範圍的縮小。青年子鼠在具有一定危險的走鋼絲測試中,有恐嚇遺傳背景的先天腎虛鼠,能完成既定距離作業的時間延長了1/3 可否提示其環境適應能力的降低。成年飢餓鼠在插入貓叫取食芝麻的數量先天腎虛組降低1/3 可認為先天及後天對基本生活能力的影響。這些方法為中醫先天腎虛模型的建立,提供了新鮮的方法和指標,也豐富和發展了行為遺傳學。

           3.3  從中醫七情(情緒心理學)的傳統理論上來看,腎在志為恐(《素問•陰陽應象大論》),是生理常態,適應行為;但若過恐傷腎,則是病理狀態,過分應激。貓是鼠的天敵,在鼠類的種系進化過程中,有大量的貓捕捉鼠,並被吃掉的危險場面,這種深刻的信息﹐或許至今仍在遺傳基因中。雖然我們採用實驗鼠的祖輩已幾十年未見過貓,未聽過貓叫,但是貓一出現仍十分恐懼,說明這種先天恐懼在遺傳背景中依然存在。當母鼠孕期受這種嚴酷的情景刺激,多次強化先天恐懼,母鼠必然恐傷腎,許多鼠已喪失生殖能力,此實驗中生殖率降低了一倍[7]。而勉強能生殖的母鼠所生子代鼠即為先天腎虛之子鼠。因為恐傷腎,母鼠被傷及腎精,損其腎氣,其生命活動的基本功能,包括生殖功能有所降低,所生的子鼠因其先天之精稟受於父母的生殖之精,它與生來,是構成胚胎發育的物質來源。母虛子亦虛,直接因果關係,則子代小鼠先天之氣自然不足,為先天腎虛鼠。其本能行為基本活動能力低下,其測試中的翻轉身體、自由活動、攀登爬行和尋食覓食等方面能力都降低。今後若能對恐傷腎外顯行為之病、弱、異充分的系統研究,進一步規範這些行為遺傳測試方法,可作為先天腎虛證的指標。

           在《內經》的五志和九氣中,在《三因極一病證方論》的七情和七氣,以及《醫宗金鑒》關於胎氣的論述中,腎志的典型之氣為恐,亦涉及到驚氣。《素問•舉痛論》強調:恐則氣下驚則氣亂,說明恐懼和驚嚇的刺激,首先是對機體的氣機運行產生不良的影響。恐則氣下,在恐懼應激狀態下,上焦的氣機閉塞不暢,可見活動減弱,行為萎縮:紊亂之氣亦可迫於下焦,或可見少腹脹滿,便尿失出;或可見二便自流,失之收澀,或見四肢顫抖,軟弱無力,甚至萎弱、癱瘓不用。驚則氣亂,是指正常的生理功能活動,遭到一時性的擾亂,出現心神不定、手足無措,驚則心無所倚,神無所歸,慮無所定,故氣亂矣(同上)。

           人們易於觀察到驚恐的上述急性應激的種種行為異常表現,然而本實驗還提示了深遠的隔代行為的影響。對這種異常的行為遺傳表現,如果用陰陽學說可進行兩極化的概括,在通常無危險環境中(空地、翻身等)表現為活動行為能力減弱,活動範圍變窄等。而在危險環境(走鋼絲、獨立鋼管頂端等)則表現為過分警覺,行為遲緩,難以完成既定的活動要求。

           當然先天行為表現廣泛,又極其複雜,我們此次行為遺傳實驗,僅是開始,尚需廣泛深入地摸索條件,深入工作。如翻身測試中,對翻身失敗的鼠,還可以觀察比較其四肢活動的次數和頻率;在翻身成功鼠中,還可以計算成功時間的長短。就是說在翻身測試中不僅要注意成功的,還應注意其行為過程中的,並進一步控制其外部環境條件,使之定性、客觀、準確,以便將來規範地評定先天腎虛證。

           3.4  從藥理遺傳學思想來看,先天藥補腎的理論上有獨到的見解,實踐上有獨特的療效,實驗上有可喜的數據。中醫藥用自然藥物補益腎氣,是當今中藥藥理學研究的熱門,在本代已作了很多有效的實驗研究。但腎為先天之本,補腎於母,補益先天,對下一代腎氣有沒有康復作用呢?有多大的作用?雖然中醫藥文獻有簡單的記載,臨床上個別人有體會,但是從未進行過實驗論證。本實驗首先開拓這個方面的研究。

           本實驗中採用金匱腎氣丸補腎的反證組可以看見,補腎藥確實對母代腎虛有補益的作用,可表現在對子代先天腎虛有一定康復效果。在反證組比恐嚇組可見子代初生鼠翻身成功率提高了一倍,在少年鼠空地測試中也提高活動量近一倍,在插入貓叫取食芝麻的量也提高1/3 均已達到非常顯著性差異。盡管成年鼠的空地測試、走鋼絲測試,成年鼠未插入貓叫的取食芝麻測試等統計學上無意義,但其平均數均有所提高。本文46次測試中,反證組與對照組的t檢驗差異無顯著性, 說明了補腎藥對先天腎虛證能有康復作用,可促進受恐嚇後恢復於正常水平,若進一步科學論證之,揚此之長,那麼中醫遺傳學可在遺傳學方面作出特殊的貢獻。為什麼金匱腎氣丸可治療先天腎虛證,可使行為遺傳測試指標恢復於正常呢?我們設想,補腎藥可調節有關本能行為的基因表達,促進或激活某些有關基因,而使其行為恢復正常。這也是我們下一步要作的基因表達差異的研究的考慮。

           現代藥理遺傳學的深入發展[8] 在子代、種系或個體的遺傳背景基礎上,對用藥的差異和藥效等方面作深層次的研究。中醫辨證論治實質是因個體差異及其表現,採用有針對性的用藥,而因人、因時、因地制宜。其中也包括根據個體間、種群間的遺傳背景差異的基礎而用藥的思想。今天中藥藥理學雖有長足發展,但仍未深入到藥理遺傳的層次研究。本實驗結果提示中藥藥理學向著藥理遺傳學方向發展的可能性和必要性,以揚中醫的辨證論治、中藥的先天用藥之長。

           遺傳藥理學中對子代或種群的藥代動力、藥物效和藥理毒性等方面作深層次研究,作為中藥的藥理遺傳學思想的研究,今天也應提到議事日程上來。盡管在藥代動力學方面天然藥物研究還相當困難,然而在子代藥效學方面是可以起步的。本研究先天藥補腎,已顯示了某些藥物效應的功能,有很好的苗頭。至於中藥的藥理毒性遺傳學方面,中醫界僅作過一些間接目的的工作[9],今後需要作明確目的藥理遺傳方面的工作。另外,我們這次實驗也提示:先天藥補腎,對於正常的子代對照組再進行補腎幾乎沒有明顯的作用。 本文的6種測試中,除初生鼠翻身測試外,其它補腎組均與對照組處於同一水平上,即都沒有顯著性差異。我們這樣理解,藥物多在非正常條件下,才有調節基因表達的功能,而表現出對行為遺傳的條理和康復作用,就是說補腎藥在基因正常表達、行為正常的條件下,一般不產生加性效應。

           總之,本實驗採用貓鼠天敵方法,首造先天腎虛證模型,並移植和建立了一些行為遺傳的新方法,以評定先天腎虛證的證狀,以考察先天補腎藥的療效,於中醫學、中醫遺傳學有一定創新開拓的作用,對行為遺傳學、情緒心理學、藥理遺傳學等也有一些新的啟示和補益[10]

參考文獻

           〔1〕王米渠.論從腎為先天之本中醫遺傳學.中國中醫基礎醫學雜誌, 1996, 2(4):3

           〔2〕Thompson WR. Science 1957 125:698

           〔3〕沈  雁、匡調元、張偉榮等.恐傷腎的實驗研究.中國醫藥學報,1991:(1):13~16

﹝4﹞王米渠、曾祥國、馬向東等.恐傷腎造模對子代鼠腦超微結構的觀察.成都中醫藥大學學報  1996;19(4):37~39

           〔5〕Thompson and Meltzer. Communication of emotional intent by facial exression, J.abnorm. Soc. psycpol 1964:129~135

           〔6〕Jerry Hirsch, S. F. Stoltenbery. Uses and Misuses of Beharior-Gehetic Comcepts in the Study of Development: From Flies to Humans. Herditym, Nervous System, and Behavior: Symposium Abstracts 1995:297

           〔7〕王米渠、段光周、馬向東等.恐傷腎母鼠的行為與生殖功能的實驗研究.中醫雜誌1997 38(3):176-177

           〔8〕W. Kalow. Development of pharma-cogentics from a perspetive Behavior Genetics Vol 1995 25(3):298

           〔9〕姜廷良等.六味地黃丸的生殖毒性的研究。見陳奇主編:中藥藥理研究的方法。人民衛生出版社,1993:159

           〔10〕王米渠、駱永珍、王宇等.腎為先天之本行為遺傳的免疫學研究。美國中醫科學,1996;2(增):12~13

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*國家自然科學基金項目(批准號39570848)腎為先天之本遺傳行為的實驗研究

中國•成都第二農業科學研究所遺傳室,中國•成都中醫藥大學,(610075)


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