化瘀止痛片对模型大鼠异位子宫内膜细胞因子影响的实验研究

谭万信        吴涢婷

中国四川成都中医药大学(610075)

 

目的:在前期研究基础上,进一步地揭示化瘀止痛片对内膜异位症的药物效应,研讨作用机理。

方法:将性成熟未交配过的雌性SD大鼠,手术造成自体子宫内膜移植动物模型。造模动物随机分为4个组:①丹那唑阳性药对照组,②化瘀止痛片高剂量组③化瘀止痛片低剂量组④模型对照组。采用HE染色和免疫组化方法对内膜异位症模型动物异位内膜组织的细胞粘附分子(ICAM-1)、基质金属蛋白酶-2及基质金属蛋白酶抑制剂-2MMP-2TIMP-2)、血管内皮生长因子(VEGF)Ki-67、细胞核因子κB (NF-κB)、肿瘤坏死因子(TNF-α)Caspase-3、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)进行检测。

结果HE染色光镜下显示:丹那唑阳性组、中药组异位内膜的腺体明显的减少,与空白对照组有显著性差异,其中阳性组对腺体的抑制作用更强。ICAM-1:化瘀止痛片高剂量组数值降低,与模型组比较,有显著性差异,p<0.05;阳性组数值降低,但与模型组比较,无显著性差异。TIMP-2:模型组含量最低,化瘀止痛片的高剂量组、阳性组与模型组比较分别有显著性差异,p<0.05VEGF:模型组表达最高,化瘀止痛片的高剂量组数值最低,后者与模型组比较有显著性差异,p<0.05TNF-α:模型组TNF-α数值最高,化瘀止痛片的高剂量组、低剂组以及阳性组均与模型组比较有极显著性差异,p<0.01。阳性组与化瘀止痛片的低剂量组有极显著性差异,p<0.01Caspase-3:高剂量组明显升高与模型对照组有显著性差异。ER:中药高剂量组、阳性组数值降低,分别与模型对照组有显著性差异。

结论:化瘀止痛片通过明显抑制细胞粘附分子的作用,抑制异位内膜对腹腔的粘附;促进异位内膜的细胞凋亡;对异位内膜的血管生成有明显的抑制作用,对异位内膜引起的炎性反应有明显的抑制作用,促进异位内膜的萎缩;降低异位内膜的雌激素受体,多层次地促使异位内膜萎缩。

关键词:化瘀止痛片 子宫内膜异位症  细胞因子 实验研究

 

Abstraction

Objects: To explore the effect mechanisms of HUAYUZHITONG tablets and to evaluate the effects in treating endometriosis.

MethodsEndometriosis was surgically induced in the female SD mice in first 4 weeks. Then they were divided into different models: control group, Danazol capsule group, HUAYUZHITONG tablet group with lower dosage, and HUAYUZHITONG tablet group with higher dosage. The ectopic endometriums in mice were observed by Immunohistochemical method to detect the expression of Caspase-3MMP-2TIMP-2NF-κBKi-67TNF-α、VEGF ER PRICAM-1.

Results: ICAM-1Expression of ICAM-1in HUAYUZHITONG tablet group with higher dosage is the least in all groups. There is significant difference in the expression between control group and HUAYUZHITONG tablet group with higher dosage (p<0.05). There also significant difference of TIMP-2 among the control group, HUAYUZHITONG tablet group with higher dosage, and Danazol capsule group, respectively. VEGF: Expression of VEGF in the control group is the highest in all groups. There is significant difference in the expression between the control group and other groups (p<0.01). Expression of TNF-αin the control group is the highest in all groups. There is significant difference in the expression between control group and other groups (p<0.01). Expression of Caspase-3 in HUAYUZHITONG tablet group with higher dosage significantly increased. There is significant difference of Caspase-3 expression among HUAYUZHITONG tablet group with higher dosage and the control group, and the Danazol capsule group. ER: Expression of ER in the control group is the highest in all groups. There is significant difference in expression among the control group and the HUAYUZHITONG tablet group with higher dosage, and the Danazol capsule group (p<0.01).

Conclusions: HUAYUZHITONG tablet may promote the withering of ectopic endometriums of mice in different ways1. Inhibiting the ectopic endometrium adheses to peritoneum by means of the effect of obviously inhibiting cell adhesion molecules.2. Increasing the expression of TIMP-2 in endometriotic tissues, which can inhibit ectopic endometrial tissues from invading peritoneum 3.Increasing the expression of apoptosis of ectopic endometrium, promoting the cell of ectopic endometrium apoptosis 4. Reducing the expression of VEGF, inhibiting the neovas cularization of ectopic endometrium. 5. Decreasing the expression of TNF-α, restraining the composition of inflammatory media and the growth of endometriotic tissue 6.Increasing the expression of ER, promoting the withering of ectopic endometriums.

Key Words:   HUAYUZHITONG tablet; endometriosis; Cytokines; experiment study

 

子宫内膜异位症(Endometriosis,以下简称“内异症”)是指具有生长功能的子宫内膜组织出现在子宫腔被覆粘膜以外的部位,从而发生周期性、继发性、渐进性痛经,月经失调,并造成盆腔粘连,形成异位结节、囊肿,引起不孕等症。是一种严重影响患者身心健康及生殖功能的临床较常见的疑难病症。化瘀止痛片对内膜异位症模型动物的细胞因子和雌孕激素受体影响的实验研究,是在前期该药能改善内膜异位症模型动物血液流变的多项指标,具有良好的镇痛、抗炎作用的实验基础上,试从粘附、侵袭、血管生成、细胞增殖与凋亡方面,进一步深层次地揭示化瘀止痛片治疗内膜异位症的药物效应,研讨其作用机理。

 

1.       材料与方法:

1.1 实验动物选择:性成熟未交配过的雌性SD大鼠50只,体重200g -240g

1.2 实验药品制备:

化瘀止痛片,0.3g/片,3.33g原生药/g,试验中给药量是以生药量计。

阳性对照药:达那唑胶囊0.1g/粒。

1.3    动物模型的建立

1.3.1大鼠阴道涂片、苏木素伊红染色检查动情周期,在第三个动情周期的动情期进行手术造模

1.3.2大鼠子宫内膜异位症模型的建立:

参照Michael等方法[1],建立模型动物,清洁级环境饲养。

1.4 动物分组及处理方法 

4周后,造模动物随机分为4组:①阳性药对照组,给予达那唑0.2g/kg,②化瘀止痛片高剂量组,给予化瘀止痛片1.8/kg,③化瘀止痛片低剂量组,给予化瘀止痛片0.45g/kg,④模型对照组:灌胃等容积生理盐水(10ml/kg)。以上各组每天灌胃一次,连续四周,末次灌胃后24小时,断头处死。取出异位组织。

1.5 检测指标及方法

①各组种植异位内膜组织光镜组织学HE染色观察腺体、上皮、间质的形态。②各组种植异位内膜采用免疫组化法进行ICAM-1MMP-2TIMP-2VEGFKi-67NF-κBTNF-α、Caspase-3,观察积分光密度(IOD)

2.  实验结果

2.1组织形态观察:

肉眼可见移植物明显增大,有的呈隆起的小粒状,有些形成多房的囊肿,囊肿内充满黄色浆液。移植物被结缔组织覆盖并有血管形成,病理检查证实移植物中均有子宫内膜上皮细胞、腺体和间质的生长。空白对照组:移植物壁为平滑肌及纤维组织,内有被覆上皮细胞、腺体及间质生长良好,间质密集,个别内膜较正常内膜薄,腺上皮及表面上皮呈高柱状,增生现象明显,并向间质生长呈腺体改变。中药低剂量组:异位内膜腺体数减少,腺上皮萎缩,被覆上皮呈低立方状或扁平状,有的未见腺体,间质稀疏,有纤维化倾向。中药高剂量组:移植物呈缝隙状、个别呈环状封闭式结构,多无囊腔形成。部分子宫内膜极薄,被覆上皮矮立方状,腺体萎缩,表面血管减少,未见明显增生及假腺体改变;间质细胞小而稀疏。阳性对照组:异位内膜成呈萎缩状,腺体数减少,有的未见腺上皮,可见坏死的上皮细胞及各种血细胞。

化瘀止痛片对子宫内膜异位症SD大鼠HE染色腺体表达的影响( IOD) ,1

1

组别             例数                       HE (X±SD)

空白组            8                        6808.15±1068.50

阳性组            8                        2778.85±758.57●●

低剂组            8                        5482.66±817.07●●▲▲

高剂组            8                        3519.70±880.96●●

●●与空白组比较: p<0.01▲▲与阳性组比较: p<0.01

结果表明阳性组、中药组对异位内膜的腺体有明显的抑制作用,促进异位内膜的萎缩。其中阳性组对腺体的抑制作用更强。

2.2免疫组化指标测定

2.2.1化瘀止痛片对子宫内膜异位症SD大鼠ICAM表达的影响( IOD),见表2

2  

 组别          例数                           ICAM( X ±SD)

空白组          8                         23458.22±5017.46

阳性组          8                         22295.35±8098.35

低剂组          8                         23981.52±6103.68

高剂组          8                         16650.75±3758.30

与空白组比较:p<0.05,

结果显示:化瘀止痛片高剂量组有明显抑制细胞粘附分子表达的作用。

2.2.2化瘀止痛片对子宫内膜异位症SD大鼠MMPs-2TIMP-2表达的影响( IOD),见表3

3  

组别       例数            MMPs-2( X ±SD)           TIMP-2(X±SD)

空白组       8            12830.56±2689.91        4414.59±600.17

阳性组       8            10931.77±1166.72        5476.35±901.91

低剂组       8            11153.53±1561.14        5140.79±633.84

高剂组       8            10809.52±1191.41●▲        5299.26±858.91

与空白组比较:p<0.05 与阳性组比较:p<0.05

    结果显示:化瘀止痛片的高剂量组、阳性组对异位内膜的侵袭有明显的抑制作用。

2.2.3化瘀止痛片对子宫内膜异位症SD大鼠VEGF表达的影响( IOD),见表4

4  

组别              例数                       VEGF (X±SD)

空白组             8                        20173.56±4947.11

阳性组             8                        17043.99±3656.28

低剂组             8                        16896.88±4405.76

高剂组             8                        13667.40±5949.67

与空白组比较:p<0.05,

结果表明:化瘀止痛片的高剂量组对异位内膜的血管生成有明显的抑制作用。

2.2.4化瘀止痛片对子宫内膜异位模型大鼠Ki-67NF-κB表达的影响( IOD),见表5

5  

组别         例数                Ki–67(X±SD)             NF-κB (X±SD)

白组          8                 34073.25±6274.25       11389.29±2124.57

阳性组        8                 29305.41±5808.37       8347.36±2042.26

低剂组        8                 27082.46±2837.49       10722.73±2316.51

高剂组        8                 32404.86±3583.98       10482.46±2718.08

与空白组比较:p<0.05与阳性组比较:p<0.05

中药低剂量组与阳性组与空白组比较数值降低(p<0.1),提示其有抑制细胞增殖的的趋势。

2.2.5化瘀止痛片对子宫内膜异位症SD大鼠TNF-α表达的影响( IOD),见表6

6  

组别            例数                      TNF-α(X±SD)

空白组           8                         25653.42±4701.09

阳性组           8                         20055.50±3227.41●●

低剂组           8                         14581.97±1613.21●●▲▲

高剂组           8                         18879.43±5412.17●●

●●与空白组比较:p<0.01;▲▲与阳性组比较:p<0.01

表6说明:阳性组、中药低剂量组对异位内膜引起的炎性反应有明显的抑制作用,促进异位内膜的萎缩。其中化瘀止痛片的低剂组对TNF-α的抑制作用更强。

2.2.6化瘀止痛片对子宫内膜异位症SD大鼠Caspase-3表达的影响( IOD),见表7

7 

组别             例数                            Caspase-3 (X±SD)

白组              8                         13859.35±2484.74

阳性组            8                         14467.97±2165.90

低剂组            8                         17579.79±4256.51

高剂组            8                         25032.98±6420.20●▲

与空白组比较:p<0.05,   与阳性组比较:p<0.05

表7说明:化瘀止痛片高剂量组有明显促进异位内膜细胞凋亡的作用。化瘀止痛片低剂量组与其它组无显着性差异。

 

3. 

3.1化瘀止痛片治疗子宫内膜异位症的立法、处方原则

中医学古籍中无子宫内膜异位症的病名,但据其临床征象,可将其归属“痛经”、“月经失调”、“ 癥瘕”、“不孕症”等病症范畴。据“辨证求因”之旨,我们认为内异症的基本病机是“冲任瘀阻,甚则积而成癥”,“审因论治”而拟立“活血化瘀,软坚散结,消癥止痛”大法,在《金匮要略》大黄蟅虫丸的基础上加减化裁,组成“化瘀止痛片”。

治疗离经之血,当以活血化瘀为主。然而单用活血化瘀法,又并非至善。结合西医妇科学对内异症中异位内膜的周期性增殖、分泌、脱落、出血,以及周围组织的增生和纤维化等基本病理变化的认识,治疗内异症仅仅停留在“瘀血阻滞冲任”的角度是不够的。在内异症的病机演变过程中,血瘀是其病因基础,不通则痛是其主要见证,瘀甚积而成癥是内异症病理进程的重要环节。故治疗内异症,在活血化瘀的同时,尚须重视软坚散结、消癥止痛,三者不可偏废。化瘀止痛片正是遵循这个原则,方以大黄为君,桃仁、蒲黄、五灵脂、蟅虫为臣,白芍、地黄、黄芩为佐。诸药配伍,既可深入血分以通络消积,兼有防止药性峻猛以致伤血耗血之弊。全方能使瘀血散、癥结消,冲任调畅,粘连软化,包块缩小、疼痛减轻,而内异症所见之临床诸证亦渐能改善,甚至消除。

3.2化瘀止痛片对异位内膜的作用机理探讨

3.2.1降低细胞粘附分子含量,抑制异位内膜对机体的粘附

不论内异症的发生系由何种病因引起,逆流入腹腔的内膜细胞必须先和腹膜发生粘附,内膜细胞之间也需要粘附、积聚成团,才能成功地种植生长,这些过程往往依赖于细胞粘附分子的活动。细胞粘附分子-1(ICAM-1)是其中研究得最多的粘附分子之一,主要存在于白细胞表面,子宫内膜间质细胞也有较多的ICAM。而内异症发生的种植学说与肿瘤细胞的播散很相似[3] ICAM在其中也会有变化。特别是其表达升高,可产生免疫抑制和降低自然杀伤细胞的杀细胞毒性,有助于异位组织逃避机体免疫系统和自然杀伤细胞的杀伤,对异位组织侵入腹膜、卵巢等起促进作用[4]。实验结果中药高剂量组对细胞粘附分子(ICAM-1)有明显抑制作用,说明化瘀止痛片可能通过抑制异位内膜在腹膜、卵巢和其他组织的粘附,对异位症的发生发展起抑制作用。

3.2.2抑制异位内膜对机体的侵袭,升高TIMp-2

内异症虽是良性病变,但具有远处转移和种植能力,体外实验证实异位内膜具有和癌细胞类似的侵袭。近年研究发现,细胞外基质(EMC)的降解与重建是异位内膜侵袭并种植于腹膜的关键因素之一[5]。有学者提出,基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMps)参与了子宫内膜异位症的发病机制[6] 许多研究认为子宫内膜的MMps促成了内异症异位内膜的形成和生长[7]                                     

最近的研究表明在大鼠内异症模型中发现的基质金属蛋白酶主要参与细胞外基质重建,逆流入腹腔的内膜组织发生异位粘附后,必须降解基底膜和其他的成分才能植入腹腔[8] ,内膜细胞在腹膜上附着、浸润的过程分泌蛋白酶,在局部分解基底膜并调节细胞粘附,促使异位内膜与腹膜接触有利于种植MMPs的活性可被金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitors of metallo proteinasesTIMP)所抑制。MMP / TIMP的比例增加与经期逆流于腹腔的内膜侵袭生长有明显的相关性。MMP / TIMP失衡导致细胞外基质降解,基底膜消失,促使子宫内膜在异位部位的生长。研究发现,内膜异位患者异位内膜中的MMp-29等表达增高,且主要位于腺上皮、腔上皮及一些基质细胞的胞浆内[9] ,而MMp的组织抑制剂(TIMp-1,2)表达量显著降低,这些酶破坏腹膜间质细胞的连接,降解细胞外基质,便于内膜细胞的侵蚀和生长 [10]。本实验中,中药高剂量组、阳性组都有升高TIMp-2的趋势,与其空白组有显著性差异,p<0.05;说明中药高剂量组、阳性组对异位内膜对腹膜组织的侵袭有抑制作用,可能是化瘀止痛片、丹那唑抑制异位病灶生长的一个原因。

3.2.3对血管生成的抑制

脱落的子宫内膜附着在腹腔或其他非正常位置存活,必须具备生存的营养基础,需要该组织有足够的血供。血管的发生和种植可以促进异位内膜增殖和浸润入盆腔腹膜组织内,异位内膜本身及其周围组织新的血供的建立和维持是子宫内膜异位种植存活和子宫内膜异位症发生的基础条件[11] 。近年来许多学者发现内异症与血管生成有关。血管增生是子宫内膜异位症发生的先决条件,血管内皮生长因子(VEGF)则是调节血管新生的重要生长因子,它可促使腹膜下的血管网形成从而有利于种植。本实验中,空白组VEGF含量最高,阳性组及化瘀止痛片的低剂量组VEGF含量有所降低,高剂量组数值最低,后者与空白组比较有显著性差异,p<0.05。其余两组与空白组比较无显著性差异。说明化瘀止痛片的高剂量组有明显降低血管内皮生长因子的含量,可能起到抑制血管异生,阻止异位内膜的生长的作用。

3.2.4对异位内膜增殖的影响

Ki-67是一种单克隆抗体,由多肽链构成,与细胞分裂期周期有关:只G0期为阴性,而G1的后期、S期、G2期及M期均有表达。因此能很好反应肿瘤的增殖活性[12] NF-κB:是一种广泛存在于细胞中的具有多向性调节作用的蛋白质分子,参与炎症反应、细胞增殖分化、细胞凋亡[13],具有抗凋亡的作用 [14]。本实验中,Ki-67 NF-κB各组间无显著性差异,提示阳性药物和中药对异位内膜的增殖方面没有明显的抑制作用。

3.2.5抑制炎症的反应

肿瘤坏死因子(TNF-α)是由内毒素激活巨噬细胞产生的无种属特异性细胞因子。近年研究发现,TNF与子宫内膜异位症发生有相关性。TNF功能失调可能是子宫内膜异位症发生的重要病理环节。实验结果显示:空白组TNF-α含量最高,化瘀止痛片的高剂量组、低剂组以及阳性组组均与空白组比较有极显著性差异,p<0.01。阳性组与化瘀止痛片的低剂量组有极显著性差异,p<0.01。说明化瘀止痛片与达那唑对内异症组织炎性反应具抑制作用,其中化瘀止痛片的低剂量组对异位灶的炎性反应抑制作用更强。

3.2.6对异位内膜的细胞凋亡的促成

McLaren等推测异位内膜细胞在盆腔内得以继续存活及种植,很可能与其对凋亡的抵抗力增强有关。Caspase-3主要与细胞凋亡的最终执行有关,是效应Caspase 。本实验中,中药高剂量组明显升高Caspase-3的含量,与空白对照组有显著性差异,而其余各组间无显著性差异。说明高剂量组能通过对Caspase-3的影响而促进异位内膜的凋亡,进而引起异位内膜的萎缩。

3.2.7降低异位内膜组织中的雌孕激素受体影响

内异症是雌激素依赖性疾病。已经证明,异位内膜的生长和维持也依赖于周期性卵巢激素的刺激,且同样通过雌、孕激素受体发挥作用。异位病灶的上皮和间质细胞内有雌激素、孕激素受体表达,并具有与月经周期不完全一致的周期性变化。

本实验结果显示,化瘀止痛片高剂量组和阳性对照组ER的数值都降低,与空白组比较,有显著性差异,p<0.05;两组之间比较无显著性差异。化瘀止痛片低剂量组与空白对照组相比,无显著性差异。化瘀止痛片高剂量组和阳性对照组有明显降低异位内膜细胞组织的雌激素受体的作用。这一结果与本课题在前期研究中所观察到ER生长受到一定程度抑制的现象是吻合的。本实验中,各组间PR无显著性差异。提示本实验中,丹那唑与化瘀止痛片对异位内膜的抑制作用与孕激素受体表达无明显相关性

 

 

参考文献 ()


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