RESEARCH, APPLICATION AND EVALUATION OF TCMM中藥研究、應用和評價〕
Immunoregulating Function of Scutellaria Barbata D. Don in Tumor--Bearing Mice

半枝蓮對荷瘤小鼠免疫調節作用的實驗研究

By Ping Ma

中國•成都中醫藥大學   


           Ping Ma:   Abstract:   The experiment was designed using mice scarcoma -- 180 ascitic tumor models and observing the effect of boiled agent, Scutellaria Barbata D. Don on tumor bearing mice and their anti -- tumor immunity. The results showed that: (1) the red blood cell c3b receptor rosette rate (RBC--C3bRR), the direct tumor erythrocyte rosette rate (DTER), the enhancing tumor erythrocyte rosette rate (ETER), the associate tumor erythrogte rosette rateATER), the natural killer cell (NKC) activity and the interleukin -- 2 (IL--2) activity of the tumor -- bearing model group were significantly lower than those of the normal control group (P<0.01 except in NKC activity and  IL -- 2 activity, which were P<0.001); (3) the RBC -- C3bRR, DTER, ETER, ATER, NKC activity and the IL -- 2 activity of the Scutellaria barbata D. Don treating group were significantly  higher than those of the tumor -- bearing group (P<0.05); (4) the RBC -- ICR of the Scutellaria barbata D. Don treating group decreased significantly compared with that of the normal control group (P<0.05). The above results suggested that : (1) the activity of red blood cell immuno-adhesion, the ability of red blood cell immuno-adhesion and attacking tumor cells, the NKC activity and the IL -- 2 activity in tumor -- bearing animals be in a significantly lower condition; (2) Scutellaria barbata D. Don significantly promotes the red blood cell immuno-adhesion activity, the ability of red blood cell immuno-adhesion and attacking tumor cells, the NKC activity and the IL -- 2 activity in tumor -- bearing animals, This study might afford immunological experiment basis of utilizing Scutellaria Barbata D. Don as a new anti - tumor drug.

 


           材料與方法

           一、材 

           1.動物  昆明種封閉群小屬,雌雄各半,體重20±2克, 由中國醫學科學院輸血研究所提供。一級動物,合格證號:川動管83號。

           2.藥品  川產半枝蓮,由四川省中藥材公司提供。經鑑定為唇形科植物半枝蓮全草。將所需半枝蓮先後按1:101:5加水煎煮兩次, 沸後微火煎30分鐘,過濾合併兩次藥液,濃縮成1克原生藥/毫升水煎劑,4°C保存備用。

           3.主要試劑(1)RPMI1640 GIBCO公司產品;(2)ConASDSServa公司產品;(3)四甲基偶氮唑鹽(MTT)SIGMA公司產品;(4)二甲基甲銑胺(DMF)天津化學試劑二廠;(5) 1:12豚鼠血輕致敏與未致敏酵母菌液(1×108/ml) 由成都中醫藥大學微生物教研室提供;(6)正常人B型紅細胞,由成都中醫藥大學學生獻血員提供。

           4.細胞株(1)S180癌細胞株,由華西醫科大學腫瘤研究所提供,無菌轉種昆明系小鼠腹腔傳代。用時無菌抽取被種小鼠腹水,加入生理鹽水稀釋離心洗滌1次,配成1×107/ml細胞懸液備用。(2)IL-2依賴細胞株CTLL及靶細胞株Raji由華西醫科大學免疫室提供。

           5.主要儀器(1)脢聯免疫檢測[KB1] 儀,華東電子管廠。(2)二氧化碳孵箱, SHELLAB公司產品。(3)96孔平底細胞培養板NUNC公司產品。

           二、方 

      1.動物分組  小鼠在實驗室條件下飼養適應1週後,隨機分為四組,即正常對照組, 正常喂藥組,荷瘤模型組,荷瘤喂藥組,每組11隻小鼠,其中後兩組造模。

           2.肉瘤S180腹水型荷瘤小鼠模型的建立   無菌抽取S180腹水型小鼠腹水,用0.85%生理鹽水按1:31:10稀釋,調整細胞濃度至1×107/ml,每隻小鼠腹腔注射0.2ml

           3.給藥方法  造模後24小時內開始喂藥,喂藥組分別用半枝蓮煎劑0.4ml//日, 灌胃給藥,相當於15克生藥每千克體重每日,連續給藥10天;正常對照組與荷瘤模型組同時喂飼等量生理鹽水。

           4.標本採集  停止喂藥後的次日,(1)採用摘除眼球取血,分離紅細胞核血清,分別作紅細胞C3b受體花環、紅細胞免疫復合物花環、 腫瘤紅細胞花環試驗;(2)小鼠處死後無菌取脾,分離脾細胞分別作IL-2活性、NK細胞活性檢測。

           5.各項指標檢測方法

           (1).RBCC3bRRRBCICR測定  按郭氏法稍加改進進行。取小鼠靜脈血1滴於2ml生理鹽水中洗滌離心3次,每次1000rpm5min,配成 1.25×108/mlRBC懸液備用。取兩試管, 每管加待測RBC懸液75ul,第一管加補體致敏酵母菌液(1×108/ml)75ul,第二管加未致敏酵母菌液(1×108/ml)75ul,搖勻置37°C水浴30min,取出加生理鹽水100ul混勻,加0.25%戊二醛50ul輕輕混勻, 取三分之一量水平塗片,自然乾燥,瑞氏染色,高倍鏡下計數200個紅細胞, 以粘附兩個或以上酵母菌的紅細胞為一個花環性細胞, 算出百份率, 第一管為RBC-C3bRR,第二管為RBC-ICR

           (2).三項腫瘤紅細胞花環試驗  按郭氏法檢測。步驟如下:每個標本分別採集血清和紅細胞,紅細胞用生理鹽水洗兩次, 配成1×108/ml懸液。採集正常人B型紅細胞,生理鹽水洗兩次後配成1×108/ml懸液。從S180荷瘤小鼠腹水中獲得S180細胞,生理鹽水洗1次後配成1×107/ml懸液。

           1)單測紅細胞免疫粘附腫瘤細胞活性,用“直向腫瘤紅細胞花環試驗(DTER)”。正常豚鼠血清100ul加濃度為1×107/ml S180細胞懸液100ul37°C水浴30min,離心1500rpm5min,棄上清、恢復體積至100ul,加待測紅細胞懸液(1×108/ml)100ul10%小牛血清25ul 37°C水浴30min,取出加生理鹽水75ul0.25%戊二醛50ul,搖勻,取出1/3量水平抹片,自然乾燥,瑞氏染色,高倍鏡下計數200個腫瘤細胞,以粘附3個或以上紅細胞的腫瘤細胞為一個花環陽性細胞,算出百分率。

2) 單測血清中補體樣物質對紅細胞免疫粘附腫瘤細胞的增強作用,用“促腫瘤紅細胞花環試驗(ETER)”。 各實驗組小鼠待測血清加S180細胞懸液(1×107/ml)100ul37°C水浴30min,離心1500rpm5min,去上清後恢復體積至100ul,加正常人B型紅細胞懸液(1×108/ml)100ul 37°C水浴30min,以下步驟同上述DTER方法。

           3)同時測定同一份標本中紅細胞與血清中補體樣物質在免疫粘附腫瘤中的協同作用,用“協同種瘤紅細胞花環試驗(ATER)”。 待測血清100ulS180細胞懸液 (1×107/ml)100ul 37°C水浴30min 離心1500rpm 5min,去上清後恢復體積至100ul 加待測紅細胞懸液(1×108/ml)100ul37°C水浴30min,以下步驟同上述DTER試驗。

           (3).IL-2活性測定  由華西醫科大學免疫室參照周氏報導方法進行檢測。取各實驗組小鼠脾細胞(無菌操作),Hank's液洗滌後用5%FCSR-PMI1640調成2×106/ml懸液,加conA30ug/ml 37°C5%CO2培養48小時,上清即含IL-2。培養上清100ul加入96孔培養板,同時作標準品及培養液對照。 IL-2依賴株CTLL5%FCSR-PMI1640 調成1×105/ml懸液,加入上述96孔板,100ul/孔,37°C5%CO2培養24小時,離心去上清110ul/孔,加入MTT10ul/孔,繼續培養6小時,加20%SDS50%DMF溶解液100ul,培養3小時, 570nm630nmOD值。IL-2活性計算:


 

樣品(OD570-OD630)-細胞對照(OD570-OD630)

IL-2活性=───────────────────×標準品活性(IU/ml)

標準品(OD570-OD630)-細胞對照(OD570-OD630)

 


           (4)﹒NK細胞活性測定由華西醫科大學免疫室按張氏報導方法進行。無菌條件下取小鼠脾細胞,Hank's液洗2次,不完全RPMI16401,5%FCS-RPMI1640調成2×106/ml每份樣品作五個復孔,其中三孔為測量孔,兩孔為效應細胞對照孔。取傳代培養的對數生長期Raji細胞,用5%FCS-RPMI1640調成5×104/ml細胞懸液,加入上述測量孔,100ul/孔,同時作靶細胞對照。 5%FCS-RPMI1640將對照組補足200ul/孔,平板置37°C5%CO2培養24小時,離心1500rpm5min 棄上清110ul/孔,加入MTT10ul/孔, 繼續培養6小時, 20%SDS-50%DMF100ul37°C培養3小時後測定570nmOD值, 自然殺傷細胞活性計算:


 

測量孔OD均值—效應細胞孔OD均值

NK細胞活性=(1—──────────────────)×100%

靶細胞對照孔OD均值

 


實驗結果

一、半枝蓮對荷瘤小鼠RBC-C3bRRRBCICR的影響

實驗結果如表1所示:

 

表1  各組小鼠RBC-C3bRRRBC-ICR(`C±SD%)

組別

動物數

RBC-C3bRR

RBC-ICR

正常對照組

11

9.7±1.6

7.4±102

正常喂藥組

10

11.2±2.0

8.5±2.2

荷瘤模型組

8

5.6±1.1**

10.5±1.2**

荷瘤喂藥組

10

7.8±2.4★☆

8.7±1.4★☆

*表示與正常對照組比較P<0.001;★表示與荷瘤模型組比較P<0.05;☆表示與正常對照組比較 P<0.05

 

           從表1可見: (1)荷瘤模型組RBC-C3bRR顯著低於正常對照組,而其RBCICR則極顯著高於正常對照組;(2)荷瘤喂藥組RBC-3bRR較荷瘤模型組明顯升高,但與正常對照組比較仍有顯著性差異; 而其RBC-ICR雖較荷瘤模型組明顯降低但仍高於正常對照組。(3)正常喂藥組RBCC3bRRRBCICR與正常對照組比較無顯著性差異。

二、半枝蓮對荷瘤小鼠DTERETERATER的影響  實驗結果如表2所示:

 

表2  各組DTERETERATER比較(`C±SD%)

組別

動物數

DTER

ETER

ATER

正常對照組

10

9.6±3.4

11.7±2.9

9.8±2.3

正常喂藥組

10

10.1±2.5

9.5±2.1

8.7±1.9

荷瘤模型組

8

5.1±1.5

8.0±1.1

4.9±1.3

荷瘤喂藥組

9

7.6±2.Δ

9.9±2.3Δ

6.6±2.2Δ

與正常對照組比較,*表示P<0.01,**表示P<0.001;Δ表示與荷瘤模型組比較,P<0.05

       

從表2可見:(1)荷瘤模型組DTERETER顯低於正常對照組,而ATER下降則更顯著(P<0.001);(2) 荷瘤喂藥組DTERETERATER較荷瘤模型組明顯昇高,且與正常對照組無顯著性差異(P>0.05) 正常喂藥組DTERETERATER等各項指標與正常對照組間無顯著差異(P>0.05)

三、半枝蓮對荷瘤小鼠IL-2活性的影響  實驗結果如表3所示:

 

表3  各組小鼠IL-2活性比較(`C±SD IU/ml)

組別

動物數

白細胞介素–2活性

正常對照組

10

19.00±2.79

正常喂藥組

10

20.50±3.03

荷瘤模型組

10

11.40±2.17**

荷瘤喂藥組

10

13.30±1.57Δ**

注:**表示與正常對照組比較P<0.001 Δ表示與荷瘤模型組表較P<0.05

 

           由表3可見,荷瘤模型組IL-2活性較正常對照組明顯降低,荷瘤喂藥組IL-2活性較荷瘤模型組顯著升高,但仍顯著低於正常對照組。

四、半枝蓮對荷瘤小鼠自然殺傷細胞活性的影響  實驗結果如表4所示:

 

表4  各組小鼠NK細胞活性的比較(`C±SD%)

組別

動物數

自然殺傷細胞活性

正常對照組

10

50.8±6.0

正常喂藥組

10

55.1±5.6

荷瘤模型組

10

29.3±4.8**

荷瘤喂藥組

10

33.7±3.8Δ**

注:**表示與正常對照組比較P<0.001 Δ表示與荷瘤模型組表較P<0.05

 

           由表4可見,荷瘤模型組NK細胞活性較正常對照組明顯降低,荷瘤喂藥組NK細胞活性與荷瘤模型組比較有明顯升高,但仍低於正常對照組。

五、幾項實驗結果相關分析

           1.RBC-ICRRBC-C3bRR  結果如圖1所示(圖略), 各組RBC-ICRRBC-C3bRR 均呈線性負相關。

           2.RBC-ICRDTER  結果如圖2(圖略)所示, 各組RBC-ICRDTER均呈現性負相關。

           3.IL2活性與NK細胞活性  結果如圖3所示(圖略):各組IL-2活性與NK細胞活性均呈線性正相關。

           4.DTERIL-2活性 結果如圖4所示(圖略),各組DTERIL-2活性均呈線性正相關。

           5.DTERNK細胞活性  結果如圖5所示,各組DTERNK細胞活性均呈現性正相關。

 

           一、紅細胞免疫與白細胞免疫在腫瘤免疫中的作用概述

           參與機體抗腫瘤免疫機制主要是細胞免疫,抗原呈遞細胞(APC)攝取腫瘤抗原, 加工成多汰分子,由細胞表面MHC分子呈遞給CD4+T細胞抗原受體與腫瘤抗原結合後,提供其活化的第一信號, APC上的某些分子如細胞間粘附分子(ICAMs)、淋巴細胞功能相關抗原3(LFA-3) 等與CD4+T細胞提供活化的第二信號。 CD4+T細胞活化後產生IL-2並表達IL-2受體(IL-2R)IL-2通過IL-2R發揮如下效應:(1)刺激T細胞增殖;(2)促使CD4+T細胞合成分泌IL-2,γ干擾素(IFN-γ) 腫瘤壞死因子(TNF)等細胞因子,這樣IL2實現了正反饋調節, 而其中的IFN-γ、TNF均有抗腫瘤活性和免疫調節作用; (3)作用於巨噬細胞為代表的APC,誘導其表達MHC分子而增強呈遞作用。此外IL-2還能誘導並增強淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)的活性;IL-2 IFN-γ都能激活並增強NK細胞的殺傷活性。另一方面,NK細胞被激活後又能產生IL-2IFN-γ等,從而又實現了正反饋調節。同樣CD8+T細胞也能在LFA-3等及IL-2作用下,增殖分化為效應殺傷性T細胞, 直接殺傷腫瘤細胞。

           NK細胞是腫瘤免疫中的非特異性殺傷成分,它不需預先刺激就能殺傷腫瘤細胞,其殺傷作用無腫瘤特異性和MHC限制性, 在腫瘤免疫中處於一線位置。在有IL-2 IFN存在時其殺傷活性明顯增強,並且自身又能分泌IL-2IFN 起著正反饋調節作用,因此有人認為存在NKC-IFN-IL-2調節網絡。

           紅細胞有多種免疫功能,其中C3b受體(CR1)的免疫粘附作用尤其重要。能借CR1粘附帶有補體C3b的腫瘤細胞。通過LFA-3促進T淋巴細胞活化;被粘附的腫瘤細胞易被巨噬細胞捕捉、殺傷。紅細胞膜CR1主要功能為粘復和清除循環免疫復合物(CIC),解除IC對免疫細胞的抑制作用。紅細胞可增加IL-2的分泌,促進IL-2R的表達; 能增強NK細胞活性;因此紅細胞作用於機體不同免疫環節,全面地促進抗腫瘤免疫功能。

           二、動物荷瘤時免疫異常及其機理

           紅細胞免疫與白細胞免疫通過上述免疫細胞和免疫細胞因子網絡發揮抗腫瘤作用。當機體荷瘤時,高濃度的瘤細胞進入機體,瘤細胞的生長機制與機體免疫系統的破壞程度有關。從本實驗結果可見,荷瘤小鼠免疫功能處於全面低下狀態,表現為PBC-C3bRRDTERETERATER NK細胞活性、IL-2細胞活性、IL-2活性的降低, RBC-ICR的升高。其中,RBC-ICRRBC-C3bRR RBC-ICRDTER呈線性負相關,說明荷瘤時CIC增加, 大量免疫復合物覆蓋在紅細胞表面而使紅細胞CR1發生占位抑制, 是紅細胞免疫粘附功能和紅細胞免疫粘附腫瘤細胞作用低下的重要原因之一;荷瘤小鼠IL-2活性與NK細胞活性仍呈線性正相關關係,似體現了上述調節網的制正反饋機制。這種機制在荷瘤機體同樣存在。DTERIL2活性、 NK細胞活性呈正相關關係說明了紅細胞對兩者的調節作用, 紅細胞CR1免疫粘附活性下降可能是IL-2活性、NK細胞活性下降的重要原因。此外有報導荷瘤機體血清中免疫抑制因子存在

且活性增強而促進因子活性下降,也可能是導致IL-2活性、NK細胞活性下降的另一重要原因。

           三、半枝蓮對荷瘤小鼠的免疫功能具有明顯增強作用

           1.本實驗結果表明,半枝蓮水煎劑對紅細胞免疫粘附腫瘤細胞的功能有明顯增強作用。半枝蓮水煎劑能明顯增強荷瘤小鼠紅細胞免疫功能,表現在RBC-C3bRR DTERETERATER升高而RBCICR

低,其作用與國內其他學者報導的黃蓍多糖增強腫瘤細胞免疫相似。推測其作用機制可能包括:(1)增加紅細胞表面C3b受體活性,使其與C3b親和力增加;(2)降低荷瘤小鼠血液CIC含量,解除對CR1的占位抑制;(3)通過調節荷瘤小鼠血清中紅細胞免疫抑制因子或/和促進因子活性(即降低紅免抑制因子活性,提高促進因子活性)而發揮作用。鑒於實驗中荷瘤喂藥組RBC-C3bRR RBCICR雖有所恢復,但都未達到正常水平(P<0.05),而DTERETER以恢復至正常水平(P>0.05),而且藥物對正常動物的上述指標無明顯影響,說明半枝蓮對紅細胞免疫粘附腫瘤細胞有選擇性促進作用。另一方面,與荷瘤模型組比較,荷瘤喂藥組ATER昇高幅度不如DTER ETER 但經單側檢驗仍有顯著性差異(P<0.05) 說明當含有免疫抑制因子的荷瘤機體血清與腫瘤細胞抗原同時作用於紅細胞時,對紅細胞免疫粘附功能有“協同抑制”作用,此作用可能在一定程度上對抗了藥物對紅細胞免疫粘附功能的恢復。

           2.本實驗結果證實,半枝蓮對荷瘤小鼠IL-2活性有明顯增強作用。中草藥對IL-2活性的影響已有很多報導。我們的實驗證明半枝蓮水煎劑能明顯增強荷瘤小鼠IL-2活性,從而促進前述免疫調節網絡得良性循環。根據DTERIL-2活性呈正相關這一結果,可以認為IL-2活性與紅細胞免疫粘附功能狀態有關;更具體地說可能與LFA-3CR1活性有關。張氏也在對比試驗中發現,在ConA誘生IL-2的體系中加入高CR1活性的紅細胞,能明顯增加體系中IL-2活性。

      3.本實驗結果表明,半枝蓮對荷瘤小鼠自然殺傷細胞活性有顯著增強作用。這對前述免疫調節網絡也是一種良性的促進作用,其機理可能與紅細胞免疫粘附作用有關。關於紅細胞促進NK細胞活性早有文獻報導,郭氏曾對此現象做過詳細研究,認為其作用依賴於紅細胞的完整性, 且並非通過IFNIL-2途徑,說明其分子基礎在於紅細胞本身,此外,半枝蓮能誘生IFN,能通過IL-2途徑間接增強NK細胞活性。

           綜上所述,從本實驗結果看,半枝蓮對荷瘤機體的免疫促進作用方式與途徑是多種多樣的,其對紅細胞免疫粘附性的增強作用是重要的基本環節,通過紅細胞免疫系統發揮整體調節作用。因此紅細胞免疫粘附功能和腫瘤花環的檢測指標與IL-2活性、NK細胞活性一樣,都能反映並作為判定荷瘤機體免疫狀態機制的進一步探討,無論對抗腫瘤免疫藥理理論還是對半枝蓮抗腫瘤臨床應用及療效評價都有重要意義。本研究為半枝蓮的開發與應用提供了部分免疫學實驗依據。

 

           1.本實驗建立了S180荷瘤小鼠模型(腹水型),證明其紅細胞與白細胞免疫在全面低下狀態。

           2.首次對半枝蓮水煎劑進行了RBC-C3bRRRBC-ICRDTERETERATERIL2活性及NK細胞活性等免疫藥理實驗研究。

           3.本實驗結果發現半枝蓮水煎劑能明顯提高荷瘤小鼠紅細胞免疫粘附腫瘤細胞和清除 CIC的能力,能顯著增強IL-2活性和NK細胞活性。這可能是半枝蓮抗腫瘤作用的重要機制之一,也為開發利用半枝蓮作為抗癌新藥提供了免疫學實驗依據。


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